【变构系列原创】NMR识别变构位点及其配体的进展

核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）可以研究溶液中的蛋白质结构。与提供蛋白质单个结构信息的常规X射线衍射研究不同，NMR可同时分析一个蛋白的所有构象状态，这使得它在发现和研究变构效应中具有重要优势。NMR可以观察到当蛋白质在某一个位点通过变构效应引发构象改变，并影响另一个不同的位点的过程。同时，在多个生理和病理过程中都已经观察到蛋白质的变构调节现象，这为变构抑制剂的开发提供了机会。这些化合物不直接与蛋白质的正构位点相互作用，但会影响其结构和功能。我们认为NMR在阐明和进一步发展变构效应的关键概念中可能起重要作用。今天，我们将介绍如何利用NMR方法识别变构位点和发现新型变构抑制剂的概述，并重点阐述这个领域的几个实例。除此之外，我们还将描述了NMR如何促进对变构机制的理解。

1. 介绍

NMR是一种检测磁场中蛋白质和小分子共振频率的技术。这些共振频率由于配体结合和蛋白构象重排而变化的电磁环境而改变。蛋白质是天生具有柔性的大分子，在溶液中存在不同的构象状态。这种动态的特性对于蛋白质的酶催化、信号传导、细胞结构构建和细胞运动驱动等功能是关键的。理解蛋白质动态的基础对于阐明蛋白功能和开发靶向蛋白质的治疗方法至关重要。

开发靶向蛋白质的治疗方法的一种方法是通过变构效应，即设计在一个位点结合并在不同位点诱导构象和功能变化的配体。变构机制与蛋白质的动态性质、蛋白质的构象集分布以及配体结合造成的构象平衡的转移天生就是相关的。研究者们已经采用了几种生物物理和生化技术来研究变构效应。这些方法包括但不限于配体结合测定，基于荧光的共振能量转移实验和X射线晶体学。虽然上述这些方法提供了有关分子亲和力和结合位点的信息，但对构象转变的深度见解还是需要NMR提供。NMR在纳秒到毫秒的时间范围内提供了近乎于原子分辨率的蛋白动态过程。这些动态过程是蛋白质变构效应的基础，并阐述了它们的热力学和动力学特性。因此，NMR已成为研究蛋白质变构的首选方法。近年来，NMR方法的进步使监视构象的动态过程成为可能。我们将重点介绍如何使用NMR方法识别变构位点，调节剂和抑制剂，以及NMR如何为变构概念提供见解。

2. NMR和变构的概念

NMR有助于描述蛋白变构模型的发展。一个重要的例子是血红蛋白的变构需要，血红蛋白是红细胞中的一种四聚体氧转运蛋白。两种广泛接受的血红蛋白变构的模型是Monod-Wyman-Changeux（MWC）提出的对称（一致）模型和Koshland，Némethy和Filmer（KNF）提出的顺序模型。MWC模型假定蛋白质根据其热平衡和稳定性以两种或多种不同的对称状态存在。变构调节剂的结合使平衡偏向于这些状态之一。而KNF模型整合了蛋白质亚基进行正或负的协同作用的概念，并假设变构调节剂与一个亚基的结合会导致邻近亚基构象变为高或低的亲和力状态。

基于MWC模型，氧气与血红蛋白的S型结合曲线可以被解释为随着氧气浓度的变化导致的蛋白亚基间的协同作用，最终造成了从一种状态到另一种状态的平衡转移。但是，在高浓度磷酸盐下的NMR研究表明，血红蛋白的α亚基比β亚基对氧的亲和力更高。这一发现告诉我们，除了遵循MWC变构模型的协同机制外，血红蛋白与氧气的结合中还可以存在KNF模型中的顺序效应[6]。

动态构象模型是由Cooper等人在1984年引入的，它描述了蛋白质的变构效应中动态变化的存在，同时而构象集合没有明显的变化。这种变构取决于配体结合引起的热振幅或振动频率变化的幅度。动态变构模型将熵对平均构象集合的贡献作为热力学因素与焓贡献一起考虑，在MWC和KNF模型中也考虑了这一点。NMR方法已是为从结构上和定量地研究蛋白构象动态变化提供实验证据的基石。NMR研究扩展了变构这一概念，它不仅考虑了变构的热力学性质，而且还考量了蛋白质动力学和功能的内容。一些综述讨论了NMR方法对动态变构概念的影响。

显而易见的是，现有的变构模型只解释了蛋白质中的变构行为的某些特征，因此需要统一这些模型。为满足这种需求，研究者们开发了基于构象集的的变构模型，该模型以构象的概率集合来解释能量分布。在该模型中，蛋白质在结构整体中采样特定构象的概率被热力学公式定义为自由能平衡。核磁共振弛豫研究为基于构象集的的变构模型提供了重要支持，因为它描述了熵对变构过程的贡献。这些研究提示快速运动是构象熵的基础。重要的是，构象熵构成了蛋白质-配体相互作用自由能的主要部分这一观点因NMR得到了认同。钙结合蛋白钙调蛋白的NMR研究证明，在局部，长程或动态转换中的构象熵直接参与分子识别，从而参与蛋白质功能。

 有趣的是，化学位移分析和¹⁵N Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）弛豫分散NMR实验提供了毫秒到微秒级的骨架动力学，揭示了腺苷酸激酶的变构调节能依赖于改变蛋白酶在空间上不同的移动域的动力学性质的机理。该结构域的动力学能够改变腺苷酸激酶对其底物的亲和力。这项研究强调了蛋白质分子功能的势能面中动态区域的重要性，并暗示了蛋白质中非结构化区域可以控制蛋白热力学性质，并调节对蛋白结合伴侣的亲和力。

与此构想一致的是构象选择和转移模型，用于描述蛋白质折叠、寡聚、与调节剂的结合和蛋白的功能。该模型扩展了原有的模型，考虑多个状态的构象集合而不是简单的两态模型，从而极大地延伸了变构的概念。此外，Ranganathan研究小组通过氨基酸网络的统计图谱确定了氨基酸之间的热力学偶联及其对蛋白质构象集合的长距离影响[8、10、18]。在重要蛋白质上测试该假设也许是NMR变构研究的未来方向。

原癌基因Ras家族蛋白的研究突出了蛋白动力学在变构调节中的作用，也发现了针对Ras的一些药物。Ras蛋白（H-Ras，N-Ras和K-Ras4A和4B）是一种小GTP酶，具有保守的催化结构域和高度灵活的C端区域。它们通过在活化的GTP结合态和非活化的GDP结合态之间循环来调节重要的信号通路。Ras催化域内的致癌突变会减弱其水解GTP的能力，从而使蛋白质失去部分活性。长期以来，人们一直认为Ras蛋白仅以开和关两种状态存在。

NMR研究提供了Ras蛋白存在不同构象状态的证据。该研究发现H-Ras中存在与GTP类似物GMPPNP结合的两个状态（状态1和状态2）[1、4、16、17]。仅状态2对Raf激酶（Ras的重要调节剂）有着高亲和力。进一步的NMR研究表明，核苷酸传感开关I和开关II区域在于GTP和GDP结合的Ras中有多种构象。有趣的是，X射线晶体学研究发现，野生型的K-Ras和致癌突变型的K-Ras的变构调节有所不同，甚至Ras不同亚型之间的变构调节也不尽相同。目前，临床上仍然没有Ras抑制剂投入使用，随着抗癌疗法的发展，Ras的变构调节剂也正处在如火如荼地开发过程中。例如，Matsumoto等人已报道带有萘基的小分子在是结合GTP的H-Ras的变构抑制剂[12]。根据NMR研究，这些化合物通过萘基与H-Ras的开关I和II区之间的疏水口袋结合。结合后，该抑制剂在开关I和β2链区引起构象变化，从而变构影响c-Raf1结合。Maurer等也已使用饱和转移差异（STD）NMR来鉴定靶向K-Ras4B G12D的先导化合物片段[13]。基于STD-NMR片段的筛选产生了240个初级命中化合物，这些初次命中化合物可以靶向处于活化状态（结合了GMPPCP）和非活化状态（结合了GDP）的蛋白质。由计算生物学方法，晶体学和生物实验支持的进一步的NMR实验确定了新的结合口袋，该口袋可以干扰son of sevenless (SOS)介导的核苷酸交换，从而在细胞水平抑制K-Ras活性。由于这些配体未靶向K-Ras的催化口袋，因此它们被认为可能是变构抑制剂。因此，NMR在理解变构效应和发现变构抑制剂方面已取得了重大进展。

3. NMR方法识别变构位点和变构配体

    二维异核单（或多）量子相干性（HSQC或HMQC）实验中的化学位移及其横向弛豫优化（TROSY）对大分子量蛋白的分析可以提供有关变构的重要信息，因为这些位移可以反映构象变化。Oyen等人提供了一个HSQC如何促进了我们对变构分子靶向蛋白质的了解的例子。在大肠杆菌中，他们使用HSQC和¹⁵N标记蛋白，从而识别出了靶向二氢叶酸还原酶（DHFR）的纳米抗体的变构结合位点。DHFR以NADPH依赖性方式催化二氢叶酸（DHF）还原为四氢叶酸（THF），限速步骤是THF的释放。这是一种已被充分研究的酶。随后，他们使用了NMR弛豫实验来建立变构网络。通常，这些实验中使用HSQC框架和其他脉冲序列组件来表示蛋白质的构象动力学。通常在¹H-¹⁵N异核过疲劳效应（Nuclear Overhauser Effects，NOEs），¹⁵N自旋晶格（R1）和自旋-自旋（R2）弛豫实验中测量皮秒至纳秒级的快速运动，而松弛补偿的CPMG和失谐旋转框架松弛实验可表征慢得多的构象交换。

众所周知，在蛋白质内，相互作用网络介导了变构效应引起的构象变化的传播。通过绘制化学位移图或测量添加配体后的弛豫速率，我们可以追踪蛋白质构象的转变。如果可获得包括变构调节剂的配体库，则可以追溯蛋白质中的变构网络。这里，以Selvaratnum等人对直接由cAMP（EPAC）激活的交换蛋白的cAMP结合域的研究为例。EPAC是受cAMP调节的鸟嘌呤交换因子。在这些研究中，他们使用NMR化学位移的协方差分析（Chemical Shift Covariance Analysis，CHESCA）绘制了由不同配体结合激活的变构网络[14]。这种方法利用了5种不同的EPAC配体，这些配体可稳定HSQC实验中蛋白质的5种不同状态。一旦所有共振被分配，就可以通过成对相关性，团聚聚类和奇异值分解对不同残基的化学位移进行统计分析。可以借助残基的偶极偶合（Residual DipolarCouplings，RDC）和相邻核之间的偶极相互作用提供有关核间向量的方向信息来分析蛋白质构象。RDC的测量需要使蛋白质分子在磁场中部分取向，通常通过添加对齐介质来实现的。研究血红蛋白的Hansen等人和Lukin等人提供了一个使用RDC理解蛋白质变构的有趣例子。作者发现原始R血红蛋白的晶体结构与溶液中测得的实验RDC的很不一样，并提出血红蛋白以多种构象状态存在[5、11]。因此，二维NMR方法可以提供有关蛋白质变构的大量信息。

图1：STD-NMR的图像表示。

核磁共振已成为非常有用的识别变构配体的技术。该方法是首先使用基于配体的方法（例如饱和转移差异NMR（STD-NMR）或通过梯度光谱法（WaterLOGSY）观察到的水配体）鉴定配体，然后选择不直接与正构位点相互作用的配体。

对于与目标蛋白直接接触的配体，STD-NMR会显示比未接触的配体明显更强的信号，以此来提供与结合相关的信息（图1）。STD-NMR可以与计算生物学和细胞生物学方法结合使用以鉴定变构配体。例如，已证明饱和转移的完全弛豫和构象交换矩阵分析（CORCEMA-ST）可用于识别已知结构的蛋白质和变构配体的结合位点。CORCEMA-ST是一款软件，它使用有关饱和的蛋白质质子和各种其他参数（例如相关时间，交换速率和光谱仪频率）的信息，预测配体与受体之间相互作用的STD-NMR强度。2013年，Zhang等人开发了这种方法用于鉴定正向驱动的kinesin-5亚家族蛋白Eg5的几个配体的变构结合位点[20]。

最近，Krimm使用称为“间谍化合物”的正构片段状化合物作为研究变构配体是否结合的探针[7]。该技术通过在有或没有变构配体的情况下观察正构“间谍”分子的结合模式变化来发现配体诱导的变构效应。重要的是，间谍分子在不同于变构配体的位点结合，从而提供了一种估计配体变构结合和蛋白变构调节作用方法。此外，Von Geldern等人已使用STD-NMR鉴定了一组1,6-果糖双磷酸酶的新型的变构抑制剂。他们使用N⁶-甲基-5-磷酸腺苷（N⁶-甲基-AMP）作为与AMP变构位点结合的变构探针分子，也使用苯并恶唑苯磺酰胺类抑制剂进行了竞争性STD-NMR实验[19]。作者展示了变构小分子抑制能量转移到探针的能力，表明其可以与变构位点结合。进一步的晶体学和生物学数据已经证实了这些抑制剂的变构性质。使用STD-NMR来发现变构配体的其他例子包括筛选3-磷酸肌醇依赖性激酶1（PDK1）抑制剂，确定L-岩藻糖与病毒样颗粒的结合等温线，以及鉴定出白介素2诱导型T细胞激酶的变构抑制剂。

 在WaterLOGSY实验中，大量水分子的选择性磁化可以转移到目标蛋白质，与蛋白质结合的螯合水分子以及蛋白质-配体复合物的界面中的水分子。因此，属于与蛋白质接触的基团的配体共振将加强，而不与蛋白质相互作用的基团将产生负面信号（图2）。与STD-NMR一样，首先在基于配体的NMR筛选中鉴定所有调节剂，然后在竞争实验中选择变构化合物，并使用异核NMR实验或其他方法进一步验证。使用WaterLOGSY发现变构配体的例子包括：靶向Abl激酶的肉豆蔻基变构结合口袋的基于片段的筛选后，进行NMR分析15N缬氨酸标记的酶的构象，使用WaterLOGSY竞争测定法发现法呢基焦磷酸合酶的变构抑制剂，寻找二氢蝶呤合酶的变构调节剂，以及开发14-3-3适应性蛋白的选择性变构抑制剂。这些实例能够证明，STD和WaterLOGSY-NMR方法是鉴定变构配体的强大而快速的方法。

图2：WaterLOGSY的流程图。

由于19F的核对电磁环境非常敏感，19F NMR已成为研究蛋白质折叠/展开，动力学，酶动力学，构象变化，天然底物和配体的结合，甚至蛋白质的热力学和物理特性中的变构作用的有效方法。在含三氟甲基的化学探针中对19F化学位移和信号线宽的分析已被证明有助于研究胰岛素金属六聚体复合物的变构行为，该复合物在胰岛B细胞的胰岛素组装和储存中起着重要作用。另一个19F NMR探针1,1,1-三氟溴丙酮也曾被用于揭示柠檬酸合酶中的变构调节机制。也可以在合成过程中通过使用5-氟色氨酸和2-氟酪氨酸将19F掺入蛋白质中。这种方法有助于研究人血清白蛋白中的变构效应，以响应常见血液稀释剂华法林的结合。它也可以研究配体诱导的顶体膜抗原1（AMA1）的构象变化，这是几种抑制剂的疟疾治疗靶标，同时并在金属和DNA结合的指导下发现细菌汞抗性（MerR）操纵子的独特变构网络。Assemat等人采用了一种有趣的方法通过19F NMR研究变构。他们基于氟化学位移各向异性和交换进行筛选（FAXS，图3）[3]来鉴定葡萄糖激酶激活剂。该酶可以通过激活剂或抑制剂来调节，这些激活剂或抑制剂会影响其在活化状态和非活化状态之间的转换。19F NMR筛选方法基于间谍分子。通过监视19F自旋的R2弛豫时间，八种已知的激活剂被用于验证该方法。在类似的应用中，Skora和Jahnke开发了一种19F NMR双位点筛选测定法，以区分Abl的正构和变构抑制剂[15]。该测定法中，已知其结合特异性的氟化报告分子会被应用于活性位点或变构位点。

图3：FAXS的示意图。

评估G蛋白偶联受体（GPCR）中的构象重排是一个受益于19F NMR的使用的重要研究领域。GPCR将信号从细胞外环境传递到细胞内，是一种高度动态的蛋白质。几种方法都可以将特异性标记物掺入GPCR，以了解配体结合并深入了解激活过程。例如，Liu等人使用2,2,2-三氟乙硫醇（TET）标记β2-肾上腺素受体的胞质半胱氨酸来研究几种配体的结合[9]。19F NMR标记显示跨膜螺旋VI和VII可以采取两个构象状态，而配体可以影响这些状态的分布。Horst等人进一步的¹⁹F NMR研究确定了与配体结合和β2-肾上腺素受体构象平衡有关的热力学和动力学变化。后来，Staus等人使用¹⁹F NMR证实，阴性的变构抗体可以稳定两种构象状态之一。总之，¹⁹F NMR已广泛应用于研究蛋白质的动态变化过程并发现变构配体。

在NMR方法中，顺磁方法有着独特的地位。可以通过顺磁性探针或金属结合位点将不成对的电子产生顺磁性效应并入蛋白质结构。由于未配对电子的磁矩非常大，因此可以测量从电子到蛋白质核之间的相对较长的距离。在许多情况下，这些距离超过了NOE的6Å极限。通常，顺磁探针允许测量顺磁弛豫增强（PRE），伪接触位移（PCS）或RDC。PRE提供距离信息，而PCS可以确定电子核矢量相对于顺磁各向异性磁化张量轴的方向。顺磁性中心还可以在外部磁场中诱导大分子的部分取向，并可以测量RDC，从而提供键矢量的取向信息。因此，蛋白质中顺磁性探针能够收集多种类型的结构信息，这些信息可以描述由于变构调节而引起的蛋白质分子构象重排。

尽管顺磁性NMR方法为发现蛋白质分子中的变构调节提供了很多优势，尤其是在远距离和角度信息方面，但很少有相关应用的报道。在大多数情况下，PRES用于测量蛋白质与配体之间或蛋白质自身内部的距离。最近的一些例子包括发现内在无序蛋白α-突触核蛋白和骨桥蛋白的变构调节机制[2]，检测HIV-1逆转录酶抑制剂诱导的构象变化，以及描述结合位点上环状核苷酸的方向在鼠超极化激活的环核苷酸门控离子通道中的作用。这些研究涉及将独特的半胱氨酸残基掺入蛋白质中以附着顺磁性探针的过程。但是，在某些情况下，半胱氨酸掺入可能会引起蛋白质折叠和/或聚集的问题。此外，使用PCS和RDC的顺磁各向异性磁化率张量参数的计算可能很费力，可能会阻碍这些方法的广泛使用。尽管存在局限性，我们希望顺磁NMR的进展可以更全面地探索蛋白质变构效应。

4. 结论

作为其他方法的补充，NMR关注蛋白质动力学和构象集合对变构调节的驱动，指导了变构模型的发展。我们的综述提供了在变构模型开发中使用NMR的实例。这些例子强调了变构机制的复杂性和多样性，并暗示可能需要进一步完善变构的主要概念。我们还认为，应用高级的变构概念可能会让研究者对重要蛋白（包括Ras GTP酶和GPCRs）了解更深。了解如何通过远处的配体结合来变构地调节蛋白质功能对于药物发现也是至关重要。NMR在变构机理研究和变构配体鉴定中将会继续发挥关键作用。目前，研究者们已经广泛使用了多种基于NMR的先进方法来发现蛋白质变构调节剂，并阐明了这些化合物用来调节蛋白质功能的变构机制。毫无疑问，NMR方法的进一步完善将在蛋白质的变构调节领域带来新发现。更多内容请参见Protein Allostery in Drug Discovery一书(Springer Nature|张健/Ruth主编的国际首本变构药物发现专著发表)。

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